1.什么是化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基？

答：化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基只含有分子量和濃度已知的組分。

2.使用無血清培養(yǎng)基或組分有什么優(yōu)點(diǎn)？

答：批間一致；化學(xué)成分明確；與含血清培養(yǎng)基相比，蛋白產(chǎn)量高、細(xì)胞死亡率低、細(xì)胞活性高；培養(yǎng)基性能穩(wěn)定，后續(xù)分離純化容易，因此無需預(yù)先篩選血清批次，簡化了生產(chǎn)規(guī)程。

3.我能用DMEM替代DMEM/F12么？

答：DMEM/F12培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基的1:1混合物，因此DMEM/F12的營養(yǎng)好于DMEM。

4.如何提高有血清培養(yǎng)的細(xì)胞向無血清培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)化的成活率？

答：一般而言，將細(xì)胞從血清培養(yǎng)條件過渡到無血清培養(yǎng)需要一個(gè)過渡，可以先嘗試梯度減少原培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基，直到zui后*替換為無血清培養(yǎng)基即可。不要突然全部換掉原培養(yǎng)基，細(xì)胞可能會(huì)由于環(huán)境的突然改變不適應(yīng)而減緩增殖或出現(xiàn)大量分化。

5.如何判斷細(xì)胞合適的傳代時(shí)間？

答：一般來說，在電鏡下觀察細(xì)胞長滿孔板（或者培養(yǎng)板/瓶）的85-90%為*傳代時(shí)間點(diǎn)。但具體的傳代時(shí)間也因具體實(shí)驗(yàn)的要求、所需細(xì)胞的數(shù)量而有所調(diào)整。但如果細(xì)胞長不滿50%就傳代的話，也會(huì)影響細(xì)胞自身的增殖和生長（細(xì)胞與細(xì)胞之間也存在著“扎堆抱團(tuán)”效應(yīng)）。

6.培養(yǎng)MSCs是否需要提前鋪板？

答：針對(duì)不同的培養(yǎng)基要求不同，有一些培養(yǎng)板需要提前鋪板包被才可以使用有的不需要對(duì)使用的培養(yǎng)板進(jìn)行鋪板包被處理，MSCs可以直接進(jìn)行培養(yǎng)或傳代等，大大節(jié)省了鋪板膠的成本和人力成本。

7.日常培養(yǎng)MSCs的過程中，是否需要每天換液？

答：細(xì)胞培養(yǎng)換液時(shí)間應(yīng)該根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求一同確定。一般2-3d應(yīng)該換一次生長液。傳代操作的第二天換液，及時(shí)給新傳代的細(xì)胞補(bǔ)充營養(yǎng)成分，更有利于細(xì)胞的生長。

8.如何判斷培養(yǎng)的細(xì)胞是否污染？

答：細(xì)胞污染的話，從表象來看，培養(yǎng)基會(huì)發(fā)黃渾濁，如果還可以用肉眼看到一層細(xì)沙狀的污染物沉積在培養(yǎng)液底部，則是典型的細(xì)菌污染，在電鏡下還可以看到黑點(diǎn)狀的細(xì)菌在不斷晃動(dòng)；如果肉眼看見的是白色的絲狀或者類似絮狀的物質(zhì)，在電鏡下也可觀察到類似現(xiàn)象，則可判定為真菌污染。但具體是哪一類的細(xì)菌或者真菌污染，還需要更進(jìn)一步的分析研究。

9.細(xì)胞培養(yǎng)基里添加抗生素是不是必須的？

答：抗生素的作用主要是防止細(xì)胞培養(yǎng)液中添加成分或者細(xì)胞培養(yǎng)操作過程中帶來的外界污染，加入抗生素可以有效降低細(xì)胞污染的幾率，但視培養(yǎng)條件和培養(yǎng)環(huán)境的差異而定，抗生素也不是必須添加的。

10.細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化。必須將凍存在-80°C液氮中的細(xì)胞快速融化至37°C，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

11.細(xì)胞倍增數(shù)（PD）和“傳代”之間的區(qū)別是什么？

答：細(xì)胞倍增數(shù)（PD）是在體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞總數(shù)的2倍增加。在某個(gè)特定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞倍增數(shù)的計(jì)算能夠給出一個(gè)準(zhǔn)確的細(xì)胞年齡。相比之下，傳代僅僅是指子代培養(yǎng)過程，即從培養(yǎng)容器分離細(xì)胞（使用胰蛋白酶/EDTA或accutase），然后以較低的密度接種，以便作進(jìn)一步的細(xì)胞生長。傳代通常不考慮可應(yīng)用的不同的分裂比率。不同的分裂比率產(chǎn)生一個(gè)*的傳代數(shù)量，但細(xì)胞倍增數(shù)是變化的。因此，傳代只是對(duì)實(shí)際培養(yǎng)年齡的一個(gè)粗略估計(jì)。

12.培養(yǎng)正常人體細(xì)胞可以添加抗生素么？

答：為了使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)*的生長，我們建議不要使用抗生素。在添加抗生素的情況下，大多數(shù)原代的或者正常的人體細(xì)胞的生長活性都會(huì)降低。在某些情況下，當(dāng)不能保證100%的無菌環(huán)境時(shí)，為了防止?jié)撛诘奈⑸锔腥?，建議在培養(yǎng)基中添加抗生素。

13.凍存的細(xì)胞和增殖中的細(xì)胞之間的區(qū)別是什么？

答：一般運(yùn)送細(xì)胞需要用干冰進(jìn)行保存，運(yùn)輸?shù)诌_(dá)后，必須轉(zhuǎn)移到液氮中保存，或者解凍后直接接種到合適的培養(yǎng)基中，并使用合適的組織培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

14.添加補(bǔ)充劑之后培養(yǎng)基可以使用多久？

答：一旦已經(jīng)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入補(bǔ)充劑，則在4°C的保質(zhì)期為6-8周。盡量避免將培養(yǎng)基重復(fù)加熱至37°C，這將降低生長因子的活性和L-谷氨酰胺的濃度。