什么是SURESELECT^{XT HS} ？

SureSelectXT HS 試劑盒作為安捷倫靈敏度高的雜交捕獲型文庫(kù)制備和 用于 NGS 的靶向序列捕獲解決方案，成為了 SureSelect 文庫(kù)制備試劑 家族中的成員。

----------------------------------------------主要特征---------------------------------------

• DNA 起始量 10 ng

• 針對(duì)高質(zhì)量完整 DNA 以及低質(zhì)量和高質(zhì)量 FFPE DNA 進(jìn)行了優(yōu)化

• 分子條形碼 (MBC) 標(biāo)記文庫(kù)可提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 (PPV)

• 復(fù)雜度更高的文庫(kù)，在靶標(biāo)區(qū)域中的讀出序列百分比更高

• 90 分鐘雜交和反應(yīng)預(yù)混試劑，實(shí)現(xiàn)更快速更高效的工作流程

FFPE 優(yōu)化文庫(kù)制備的重要性

盡管 FFPE 樣品為多種遺傳信息提供了有價(jià)值的來(lái)源，但從 FFPE 組織中分離 DNA 的難題 在于純化足夠分子量的 DNA 以及達(dá)到一定的擴(kuò)增和檢測(cè)質(zhì)量。通常而言，當(dāng) FFPE DNA 制備出來(lái)用于文庫(kù)生成時(shí)，其降解程度已過(guò)高而無(wú)法用于高靈敏度的 NGS。因此，有 必要通過(guò)優(yōu)化文庫(kù)制備與盡量減少步驟數(shù)降低樣品損失，并從挑戰(zhàn)性樣品類型中獲得 高質(zhì)量文庫(kù)。

針對(duì) FFPE 優(yōu)化的安捷倫文庫(kù)制備

對(duì)于新鮮樣品與 FFPE 樣品中的多種組織類型，SureSelectXT HS 僅用 10-200 ng 起始原料即 可生成靶標(biāo)區(qū)域讀出序列百分比較高的更復(fù)雜文庫(kù)。為改善不同質(zhì)量 FFPE 樣品單核苷 酸變異 (SNV) 的識(shí)別和一致性，安捷倫已開發(fā)出一款完整的工作流程解決方案，該方 案具有 DNA 質(zhì)量預(yù)評(píng)估（FFPE QC 試劑盒，部件號(hào) G9700A 和 G9700B 以及 4200 TapeStation 系統(tǒng)）和單管文庫(kù)制備功能。

 圖 1. SureSelectXT HS 已針對(duì) FFPE 進(jìn)行了性能優(yōu)化，在質(zhì)量逐漸降低的樣品中多數(shù)堿基覆蓋率達(dá)到了 20X。 將測(cè)序深度越來(lái)越高的 20X 以上讀取深度覆蓋（4 百萬(wàn)到 8 百萬(wàn) - 2×100 bp 讀出序列）的堿基百分比相對(duì)于 gDNA 質(zhì)量（基于 qPCR 的 gDNA 質(zhì)量 (ddCq)，并用安捷倫 FFPE QC 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行計(jì)算）作圖

圖 2. SureSelectXT HS 在 100X 覆蓋率下優(yōu)于其他文庫(kù)制備解決方案，尤其是在樣品質(zhì)量下降時(shí)：根據(jù) 8 百萬(wàn) - 2×100 bp 讀出序列的 1000X 測(cè)序深度，將 100X 以上讀取深度覆蓋的堿基百分比相對(duì)于質(zhì)量越來(lái)越低的 gDNA （基于 qPCR 的 gDNA 質(zhì)量 (ddCq)，并用安捷倫 FFPE QC 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行計(jì)算）作圖

高靈敏度的重要性

靈敏度指的是得到正確鑒定的真實(shí)變異的百分比。在大多數(shù)情況下，靈敏度受到起始 量、檢測(cè)性能以及 PCR 與測(cè)序錯(cuò)誤率的限制。因此，傳統(tǒng) NGS 檢測(cè)的錯(cuò)誤水平通常會(huì) 由于腫瘤異質(zhì)性而影響低頻變異的檢測(cè)可信度。

SureSelectXT HS 的出色靈敏度

SureSelectXT HS 中包括的分子條形碼可幫助用戶在文庫(kù)制備、靶向序列捕獲和測(cè)序等可能 產(chǎn)生假陽(yáng)性變異的過(guò)程中過(guò)濾出假陽(yáng)性結(jié)果。SureSelectXT HS 中的分子條形碼對(duì)罕見變異的檢測(cè)頻率低至 ≤ 1%。多數(shù)用戶采用置信閾值且僅對(duì)等 位基因頻率高于 3%-5% 的變異進(jìn)行識(shí)別，因此這一性能十分重要。

圖 3. 等位基因頻率低至 1% 時(shí)的檢測(cè)結(jié)果。SureSelectXT HS 生成的文庫(kù)在測(cè)序深度 3000X 時(shí)，即使在 VAF 頻率低至 1% 時(shí)觀測(cè)值和頻率預(yù)計(jì)值之間也具有高度關(guān)聯(lián)性（HD200 定量多重參考標(biāo)樣和 ClearSeq 綜合癌癥基因組合）

什么是分子條形碼？

分子條形碼是*的 DNA 序列，它附著在給定樣品中的每個(gè)原始 DNA 上。這些獨(dú) 特的 DNA 序列包含隨機(jī)的核苷酸、部分簡(jiǎn)并核苷酸或核苷酸。分子條形碼附著在 DNA 上，為每個(gè)起始分子分配*的識(shí)別碼。

分子條形碼為何如此重要？

PCR 擴(kuò)增和測(cè)序過(guò)程中引入的錯(cuò)誤提高了原始 DNA 模板的整體錯(cuò)誤率。這些錯(cuò)誤或假 陽(yáng)性結(jié)果降低了樣品中低水平真實(shí)突變的靈敏度。這個(gè)問(wèn)題尤其容易發(fā)生在某些腫瘤 亞群等異質(zhì)性更高的細(xì)胞群中。分子條形碼通過(guò)消除假陽(yáng)性結(jié)果并提供誤差校正以實(shí) 現(xiàn)更準(zhǔn)確的變異識(shí)別，幫助用戶檢測(cè)模板 DNA 分子中的低頻突變。

圖 4. 利用分子條形碼 (MBC) 分析提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。對(duì) Horizon cfDNA 參照和定制 164 kb SureSelect 基因組合構(gòu)建的 SureSelectXT HS 文庫(kù)進(jìn)行靶向測(cè)序，在去冗余后達(dá)到了 808（標(biāo)準(zhǔn)）/906 (MBC) 的中等覆蓋率。經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)去冗余 后，在小于 2% 的變異等位基因頻率下檢測(cè)出 216 個(gè)非參照等位基因，而采用 MBC 得到的這一數(shù)字僅為 18。這表明錯(cuò)誤識(shí)別減少了 92%。數(shù)據(jù)結(jié)果由英國(guó)倫敦癌癥研究所演化和癌癥中心的 L.J. Barber 博士和 M. Gerlinger 博士提供

 SureSelectXT HS 可減少單獨(dú)酶法步驟、清除步驟和樣品轉(zhuǎn)移，使用戶簡(jiǎn)化工作流程并維 持文庫(kù)復(fù)雜度，在較低起始量（低至 10 ng）下更是如此。我們的 90 分鐘雜交與更高效的反應(yīng)預(yù)混試劑結(jié)合使用，可使用戶 在一天內(nèi)完成從樣品處理到生成待測(cè)序文庫(kù)的過(guò)程。此外，工作流程支持在一次混 合中對(duì)多 32 個(gè)樣品進(jìn)行深度多重測(cè)序。

優(yōu)點(diǎn)

• 90 分鐘雜交和反應(yīng)預(yù) 混試劑有助于更快速 更高效地處理樣品

• 在不到一天的時(shí)間內(nèi) 將樣品轉(zhuǎn)化為待測(cè)序 文庫(kù)

• Agilent SureCall 軟件有 助于簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析 簡(jiǎn)化的工作流程有助于加快分析速度

 SureSelect 文庫(kù)制備與靶向序列捕獲解決方案

安捷倫公司具有多種文庫(kù)制備和靶向序列捕獲解決方案，適用于癌癥和遺傳性疾病應(yīng) 用。無(wú)論 DNA 起始量低至 10 ng 或高達(dá) 3 µg，文庫(kù)制備和靶向序列捕獲解決方案均可與 ClearSeq 基因組合、SureSelect 外顯子組或定制基因組合完美匹配。