羊水細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方式
更新時(shí)間：2014-09-22 點(diǎn)擊次數(shù)：2503
一、羊水細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)法
1、采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無(wú)菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無(wú)菌離心管中。
2、收集：離心分離細(xì)胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻。
3、接種：將混勻的羊水細(xì)胞種置于50ml或100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，平均10ml羊水細(xì)胞收集的細(xì)胞種置一瓶加5-10ml混合培養(yǎng)液。
4、培養(yǎng)：酒精燈火先封口，靜置培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞貼臂及生長(zhǎng)情況，5-10天后可見(jiàn)瓶底面有大量羊水細(xì)胞生長(zhǎng)。
5、終止培養(yǎng)：當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時(shí)。
6、細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)瓶底面*接觸消化酶，然后用彎頭吸管吹打，待細(xì)胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細(xì)胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘，棄上清，留細(xì)胞沉慮。若一次消化不*，可反復(fù)消化。
7、低滲及預(yù)固定：加預(yù)溫37℃KCL溶液10ml，37℃溫育30分鐘，加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預(yù)固定，用氣泡吹打細(xì)胞使其混勻。
8、固定：用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分鐘。固定液加入時(shí)沿管壁緩慢加入。
9、制片及干燥：用絨毛制片。
10、分帶處理。
二、羊水細(xì)胞培養(yǎng)基蓋玻片培養(yǎng)法
1、采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無(wú)菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無(wú)菌離心管中。
2、收集：離心分離細(xì)胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻。
3、接種：30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張，每片滴混勻的細(xì)胞液1-2滴，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30-60分鐘。
4、培養(yǎng)：取出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml，靜置培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞生殖狀況并定時(shí)換液，5-10天后，可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)。
5、終止培養(yǎng)：當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時(shí)。
6、低滲：倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)溫37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃溫育30分鐘，鏡下可見(jiàn)脹大的羊水細(xì)胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液預(yù)固定。
7、固定：倒掉低滲液，加5ml固定液固定30分鐘以上，反復(fù)3次。
8、干燥：將附有細(xì)胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中，置80℃烤箱處理2-3小時(shí)。
9、膠片：將附有細(xì)胞的蓋玻片用樹(shù)脂膠封固于玻片上，正面朝外，小心細(xì)胞破壞。
